Νέα - Παρακολούθηση των επιπέδων διαλυμένου οξυγόνου στη διαδικασία βιοφαρμακευτικής ζύμωσης

Τι είναι το διαλυμένο οξυγόνο;

Το διαλυμένο οξυγόνο (DO) αναφέρεται στο μοριακό οξυγόνο (O_₂) που διαλύεται στο νερό. Διαφέρει από τα άτομα οξυγόνου που υπάρχουν στα μόρια του νερού (H_₂O), όπως υπάρχει στο νερό με τη μορφή ανεξάρτητων μορίων οξυγόνου, είτε προέρχονται από την ατμόσφαιρα είτε παράγονται μέσω φωτοσύνθεσης από υδρόβια φυτά. Η συγκέντρωση του DO επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, όπως η θερμοκρασία, η αλατότητα, η ροή του νερού και οι βιολογικές δραστηριότητες. Ως εκ τούτου, χρησιμεύει ως κρίσιμος δείκτης για την αξιολόγηση της υγείας και της κατάστασης ρύπανσης των υδάτινων περιβαλλόντων.

Το διαλυμένο οξυγόνο παίζει ζωτικό ρόλο στην προώθηση του μικροβιακού μεταβολισμού, επηρεάζοντας την κυτταρική αναπνοή, την ανάπτυξη και τη βιοσύνθεση των μεταβολικών προϊόντων. Ωστόσο, τα υψηλότερα επίπεδα διαλυμένου οξυγόνου δεν είναι πάντα ωφέλιμα. Η περίσσεια οξυγόνου μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω μεταβολισμό των συσσωρευμένων προϊόντων και ενδεχομένως να προκαλέσει τοξικές αντιδράσεις. Τα βέλτιστα επίπεδα DO ποικίλλουν μεταξύ των διαφορετικών βακτηριακών ειδών. Για παράδειγμα, κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης της πενικιλίνης, το DO διατηρείται συνήθως σε περίπου 30% κορεσμό αέρα. Εάν το DO πέσει στο μηδέν και παραμείνει σε αυτό το επίπεδο για πέντε λεπτά, ο σχηματισμός του προϊόντος μπορεί να επηρεαστεί σημαντικά. Εάν αυτή η κατάσταση επιμένει για 20 λεπτά, μπορεί να προκληθεί μη αναστρέψιμη βλάβη.

Προς το παρόν, οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι αισθητήρες DO μπορούν να μετρήσουν μόνο τον σχετικό κορεσμό αέρα, αντί για την απόλυτη συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου. Μετά την αποστείρωση του καλλιεργητικού μέσου, πραγματοποιείται αερισμός και ανάδευση μέχρι να σταθεροποιηθεί η ένδειξη του αισθητήρα, οπότε η τιμή ορίζεται σε 100% κορεσμό αέρα. Οι επόμενες μετρήσεις κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ζύμωσης βασίζονται σε αυτήν την αναφορά. Οι απόλυτες τιμές DO δεν μπορούν να προσδιοριστούν χρησιμοποιώντας τυπικούς αισθητήρες και απαιτούν πιο προηγμένες τεχνικές, όπως η πολαρογραφία. Ωστόσο, οι μετρήσεις κορεσμού αέρα είναι γενικά επαρκείς για την παρακολούθηση και τον έλεγχο των διαδικασιών ζύμωσης.

Μέσα σε έναν ζυμωτήρα, τα επίπεδα DO μπορούν να ποικίλλουν μεταξύ διαφορετικών περιοχών. Ακόμα και όταν λαμβάνεται μια σταθερή ένδειξη σε ένα σημείο, ενδέχεται να εμφανιστούν διακυμάνσεις σε ορισμένα μέσα καλλιέργειας. Οι μεγαλύτεροι ζυμωτήρες τείνουν να εμφανίζουν μεγαλύτερες χωρικές διακυμάνσεις στα επίπεδα DO, οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν σημαντικά την μικροβιακή ανάπτυξη και παραγωγικότητα. Πειραματικά στοιχεία έχουν δείξει ότι, αν και το μέσο επίπεδο DO μπορεί να είναι 30%, η απόδοση της ζύμωσης υπό κυμαινόμενες συνθήκες είναι σημαντικά χαμηλότερη από ό,τι υπό σταθερές συνθήκες. Επομένως, στην κλιμάκωση των ζυμωτήρων - πέρα από τις εκτιμήσεις της γεωμετρικής ομοιότητας και της ομοιότητας ισχύος - η ελαχιστοποίηση των χωρικών διακυμάνσεων DO παραμένει βασικός ερευνητικός στόχος.

Γιατί είναι απαραίτητη η παρακολούθηση του διαλυμένου οξυγόνου στη βιοφαρμακευτική ζύμωση;

1. Για τη διατήρηση του βέλτιστου περιβάλλοντος ανάπτυξης για μικροοργανισμούς ή κύτταρα
Η βιομηχανική ζύμωση συνήθως περιλαμβάνει αερόβιους μικροοργανισμούς, όπως το Escherichia coli και τη ζύμη, ή κύτταρα θηλαστικών, όπως τα κύτταρα ωοθήκης κινέζικου κρικητού (CHO). Αυτά τα κύτταρα λειτουργούν ως «εργάτες» εντός του συστήματος ζύμωσης, απαιτώντας οξυγόνο για την αναπνοή και τη μεταβολική δραστηριότητα. Το οξυγόνο χρησιμεύει ως ο τελικός δέκτης ηλεκτρονίων στην αερόβια αναπνοή, επιτρέποντας την παραγωγή ενέργειας με τη μορφή ATP. Η ανεπαρκής παροχή οξυγόνου μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρική ασφυξία, αναστολή της ανάπτυξης ή ακόμη και κυτταρικό θάνατο, με τελικό αποτέλεσμα την αποτυχία της ζύμωσης. Η παρακολούθηση των επιπέδων DO διασφαλίζει ότι οι συγκεντρώσεις οξυγόνου παραμένουν εντός του βέλτιστου εύρους για αειφόρο ανάπτυξη και βιωσιμότητα των κυττάρων.

2. Για να διασφαλιστεί η αποτελεσματική σύνθεση των προϊόντων-στόχων
Ο στόχος της βιοφαρμακευτικής ζύμωσης δεν είναι απλώς η προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αλλά και η διευκόλυνση της αποτελεσματικής σύνθεσης των επιθυμητών προϊόντων-στόχων, όπως η ινσουλίνη, τα μονοκλωνικά αντισώματα, τα εμβόλια και τα ένζυμα. Αυτές οι βιοσυνθετικές οδοί συχνά απαιτούν σημαντική εισροή ενέργειας, η οποία προέρχεται κυρίως από την αερόβια αναπνοή. Επιπλέον, πολλά ενζυματικά συστήματα που εμπλέκονται στη σύνθεση προϊόντων εξαρτώνται άμεσα από το οξυγόνο. Η έλλειψη οξυγόνου μπορεί να διαταράξει ή να μειώσει την αποτελεσματικότητα αυτών των οδών.

Επιπλέον, τα επίπεδα DO λειτουργούν ως ρυθμιστικό σήμα. Τόσο οι υπερβολικά υψηλές όσο και οι χαμηλές συγκεντρώσεις DO μπορούν:
- Τροποποίηση των κυτταρικών μεταβολικών οδών, για παράδειγμα, μετατόπιση από την αερόβια αναπνοή σε λιγότερο αποτελεσματική αναερόβια ζύμωση.
- Ενεργοποιούν κυτταρικές αντιδράσεις στο στρες, οδηγώντας στην παραγωγή ανεπιθύμητων υποπροϊόντων.
- Επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης εξωγενών πρωτεϊνών.

Με τον ακριβή έλεγχο των επιπέδων DO σε διαφορετικά στάδια της ζύμωσης, είναι δυνατό να καθοδηγηθεί ο κυτταρικός μεταβολισμός προς τη μέγιστη σύνθεση του προϊόντος-στόχου, επιτυγχάνοντας έτσι ζύμωση υψηλής πυκνότητας και υψηλής απόδοσης.

Εισαγωγή στο Διάγραμμα Ροής Νερού για Βιολογικά Φαρμακευτικά Προϊόντα

3. Για την πρόληψη της έλλειψης ή της υπερβολικής ποσότητας οξυγόνου
Η έλλειψη οξυγόνου (υποξία) μπορεί να έχει σοβαρές συνέπειες:
- Η κυτταρική ανάπτυξη και η σύνθεση προϊόντων σταματούν.
- Ο μεταβολισμός μετατοπίζεται σε αναερόβιες οδούς, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση οργανικών οξέων όπως το γαλακτικό οξύ και το οξικό οξύ, τα οποία μειώνουν το pH του καλλιεργητικού μέσου και μπορεί να δηλητηριάσουν τα κύτταρα.
- Η παρατεταμένη υποξία μπορεί να προκαλέσει μη αναστρέψιμη βλάβη, με την ανάρρωση να είναι ατελής ακόμη και μετά την αποκατάσταση της παροχής οξυγόνου.

Η περίσσεια οξυγόνου (υπερκορεσμός) ενέχει επίσης κινδύνους:
- Μπορεί να προκαλέσει οξειδωτικό στρες και τον σχηματισμό δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), τα οποία βλάπτουν τις κυτταρικές μεμβράνες και τα βιομόρια.
- Ο υπερβολικός αερισμός και η ανακίνηση αυξάνουν την κατανάλωση ενέργειας και το λειτουργικό κόστος, οδηγώντας σε άσκοπη σπατάλη πόρων.

4. Ως κρίσιμη παράμετρος για παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο και έλεγχο ανάδρασης

Το DO είναι μια παράμετρος σε πραγματικό χρόνο, συνεχής και ολοκληρωμένη που αντικατοπτρίζει τις εσωτερικές συνθήκες του συστήματος ζύμωσης. Οι αλλαγές στα επίπεδα DO μπορούν να υποδείξουν με ευαισθησία διάφορες φυσιολογικές και λειτουργικές καταστάσεις:
- Η ταχεία ανάπτυξη των κυττάρων αυξάνει την κατανάλωση οξυγόνου, προκαλώντας μείωση των επιπέδων DO.
- Η εξάντληση ή η αναστολή του υποστρώματος επιβραδύνει τον μεταβολισμό, μειώνοντας την κατανάλωση οξυγόνου και προκαλώντας αύξηση των επιπέδων DO.
- Η μόλυνση από ξένους μικροοργανισμούς μεταβάλλει το πρότυπο κατανάλωσης οξυγόνου, οδηγώντας σε ανώμαλες διακυμάνσεις του DO και χρησιμεύοντας ως σήμα έγκαιρης προειδοποίησης.
- Οι δυσλειτουργίες του εξοπλισμού, όπως η βλάβη του αναδευτήρα, το φράξιμο του σωλήνα εξαερισμού ή η ρύπανση του φίλτρου, μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε μη φυσιολογική συμπεριφορά DO.

Ενσωματώνοντας την παρακολούθηση DO σε πραγματικό χρόνο σε ένα αυτοματοποιημένο σύστημα ελέγχου με ανάδραση, η ακριβής ρύθμιση των επιπέδων DO μπορεί να επιτευχθεί μέσω δυναμικών προσαρμογών των ακόλουθων παραμέτρων:
- Ταχύτητα ανάδευσης: Η αύξηση της ταχύτητας ενισχύει την επαφή αερίου-υγρού διασπώντας τις φυσαλίδες, βελτιώνοντας έτσι την αποτελεσματικότητα της μεταφοράς οξυγόνου. Αυτή είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη και αποτελεσματική μέθοδος.
- Ρυθμός αερισμού: Ρύθμιση του ρυθμού ροής ή της σύνθεσης του εισερχόμενου αερίου (π.χ. αύξηση της αναλογίας αέρα ή καθαρού οξυγόνου).
- Πίεση δεξαμενής: Η αύξηση της πίεσης αυξάνει τη μερική πίεση οξυγόνου, ενισχύοντας έτσι τη διαλυτότητα.
- Θερμοκρασία: Η μείωση της θερμοκρασίας αυξάνει τη διαλυτότητα του οξυγόνου στο μέσο καλλιέργειας.

Συστάσεις προϊόντων της BOQU για την ηλεκτρονική παρακολούθηση της βιολογικής ζύμωσης: